Το υπερηχογράφημα Β΄ επιπέδου γίνεται από την 20η έως την 24η εβδομάδα της κύησης.
Περιλαμβάνει τον έλεγχο της ανάπτυξης του εμβρύου και τον έλεγχο του πλακούντα και του αμνιακού υγρού. Όπως επίσης και τον αναλυτικό έλεγχο των οργάνων του εμβρύου για τον αποκλεισμό συγγενών ανωμαλιών.
Ελέγχονται το κρανίο, ο εγκέφαλος, το πρόσωπο, ο θώρακας, η καρδιά, η σπονδυλική στήλη, το κοιλιακό τοίχωμα, το διάφραγμα, το στομάχι, οι νεφροί, η ουροδόχος κύστη και τα άκρα του εμβρύου. Με το υπερηχογράφημα Β΄ επιπέδου, ανιχνεύεται περίπου το 70% των σοβαρών συγγενών ανωμαλιών. Εξετάζεται η ύπαρξη κάποιων δεικτών για χρωμοσωμικές ανωμαλίες (κυρίως για το σύνδρομο Down). Γίνεται ακόμη έλεγχος της ροής του αίματος στις μητριαίες αρτηρίες. Στις περιπτώσεις που το Doppler των μητριαίων αρτηριών είναι παθολογικό, αυξάνεται ο κίνδυνος να εμφανίσει η μητέρα προεκλαμψία ή το έμβρυο να παρουσιάσει υπολειπόμενη ενδομήτρια ανάπτυξη.
Στο Β΄ επιπέδου, ελέγχεται επίσης το μήκος του τραχήλου της μήτρας προκειμένου να διαπιστωθεί η πιθανότητα ενός πρόωρου τοκετού.